La technologie avancée de ribotypage aide les chercheurs à suivre les maladies mortelles
Entretien avec Seth Walk, chercheur principal et professeur agrégé, Département de microbiologie et de biologie cellulaire, Montana State University
Crédit d’image : Promega Corporation
Pouvez-vous nous présenter brièvement votre parcours et vos intérêts de recherche ?
J’ai rejoint la Montana State University en 2012, et je suis maintenant professeur agrégé et responsable du Walk Lab à l’université. Nous nous intéressons au microbiome intestinal humain, qui est actuellement un domaine assez populaire.
Nous étudions certaines questions de recherche fondamentale dans le domaine de l’écologie microbienne, telles que quels organismes vivent dans l’intestin et comment ils interagissent avec leur hôte (nous), ainsi que des questions liées aux maladies infectieuses et aux agents pathogènes résistants aux antimicrobiens qui causent des maladies dans le intestin.
Nous collaborons avec d’autres groupes, par exemple avec des partenaires qui étudient les maladies inflammatoires de l’intestin et tentent d’établir l’interaction hôte-pathogène.
Nous avons également une série de projets explorant la façon dont les agents pathogènes circulent dans les hôpitaux, dans le but de développer des outils pour suivre les épidémies et surveiller les nouveaux clones émergents qui pourraient être résistants au traitement.
L’un des principaux agents pathogènes qui nous intéresse est Clostridioides difficile. Cette bactérie à Gram positif est la cause la plus fréquente d’infection nosocomiale nosocomiale aux États-Unis et peut provoquer une maladie gastro-intestinale grave avec des taux de morbidité et de mortalité élevés.
L’épidémiologie de la bactérie est en constante évolution, nous avons donc vraiment besoin d’outils pour différencier les différents C. difficile souches.
Crédit d’image : Promega Corporation
Pouvez-vous expliquer ce que sont ces « outils » et comment ils pourraient être utilisés ?
Nous développons des outils à faible coût pour caractériser les isolats et construisons des bases de données pour faciliter le travail des autres membres de la communauté scientifique. Nous utilisons également des modèles de souris de C. difficile comprendre comment cet agent pathogène se propage et quels facteurs sont importants pour prévenir la maladie.
Au niveau hospitalier, il existe un réel besoin de « typer » les isolats, de mesurer leur diversité génétique et phénotypique. Nous avons développé un outil utilisant une technique moléculaire appelée ribotypage, qui identifie et caractérise différentes souches de C. difficile basé sur l’information génétique autour des gènes codant pour l’ARN ribosomique (ARNr).
Ces informations nous renseignent sur leurs relations phylogénétiques ; à quel point ils sont étroitement liés et si de nouvelles variantes apparaissent.
Les outils de ribotypage peuvent être utilisés dans le diagnostic clinique et le contrôle des infections, pour établir comment différentes souches pathogènes se déplacent dans un hôpital et si les épidémies sont causées par des souches récurrentes ou nouvelles.
La surveillance de la résistance est également une priorité absolue pour les communautés cliniques et de recherche, pour aider au développement de nouveaux antibiotiques. Dans le cas du contrôle des infections, le typage des souches doit être rapide, c’est là qu’intervient notre outil de ribotypage à haut débit par amplification en chaîne par polymérase fluorescente (PCR).
Comment fonctionne le ribotypage par PCR fluorescente et pourquoi utilisez-vous cette méthode par rapport à d’autres techniques ?
Le ribotypage PCR est un test de génotypage sur gel à faible coût pour l’identification de C. difficile lignées. Il quantifie les différences de longueur entre l’ARNr 16S et les gènes codant pour l’ARNr 23S à environ 11 opérons codant pour l’ARNr autour de la C. difficile génome.
En utilisant une amorce PCR marquée par fluorescence et des amplicons de dimensionnement avec un séquençage de type Sanger (à base de capillaires), le ribotypage PCR fluorescent améliore la technique de ribotypage originale et notre laboratoire a développé une approche similaire et l’a appliquée à C. difficile.
Les méthodes basées sur les séquences, telles que le typage de séquences multi-locus (MLST) et le séquençage du génome, sont coûteuses par rapport aux méthodes basées sur gel et maintenant capillaires. Les méthodes courantes sur gel comprennent l’électrophorèse sur gel en champ pulsé (PFGE) et le typage par analyse des endonucléases de restriction (REA), mais les données qui en résultent ne sont pas transférables entre les laboratoires.
La portabilité des données est particulièrement importante pour les études épidémiologiques afin que des liens puissent être établis entre les cas de maladie à travers le monde et que les modèles d’émergence puissent être identifiés rapidement. Nous avons réalisé une étude multicentrique qui a démontré la portabilité et la rentabilité de notre protocole standardisé de ribotypage par PCR fluorescente.1
Quatre laboratoires différents et trois centres de séquençage différents ont atteint une précision et une précision élevées C. difficile identifications de ribotypes à l’aide de notre protocole et de notre base de données centralisée. Ce qui est vraiment important pour la portabilité, c’est que les laboratoires parlent un « langage commun ». Si nous utilisons les mêmes conventions de nommage et les mêmes plates-formes et bases de données, les informations peuvent voyager beaucoup plus largement.
Quel rôle joue votre base de données dans C. difficile ribotypage ?
Nous avons construit notre base de données de C. difficile ribotypes depuis environ une décennie, et il contient actuellement 123 ribotypes et est disponible gratuitement en ligne. Nous avons analysé des échantillons cliniques du monde entier avec un ribotypage PCR fluorescent sur un séquenceur d’électrophorèse capillaire (CE) et nous pouvons rapidement faire correspondre les souches identifiées avec les références de la base de données.
Nous voulons que d’autres laboratoires soient en mesure de comparer leurs identifications de ribotypes avec notre base de données de référence et d’établir si le modèle correspond à un modèle précédemment nommé. C. difficile ribotype, ou une souche nouvellement identifiée qui peut ensuite être facilement ajoutée à la base de données pour de futures études.
Nous avons récemment développé un progiciel en R pour analyser rapidement les données CE, où les utilisateurs peuvent saisir et analyser des fichiers de données brutes et obtenir une métrique de similarité entre les requêtes inconnues et la base de données de référence dans un flux de travail simple.
Au début, nous dépendions d’autres sociétés pour maintenir à jour leurs bases de données propriétaires et leurs logiciels, alors qu’aujourd’hui, nous pouvons analyser et dépanner chaque fichier de données brutes reçu. Le pipeline peut même être adapté à d’autres bases de données basées sur CE – il n’est pas limité à C. difficile.
Quel est l’impact du choix du séquenceur sur votre pipeline de ribotypage par PCR fluorescente ?
Le séquençage Sanger par CE est une technologie éprouvée, et il existe désormais des instruments suffisamment compacts pour s’adapter à presque tous les laboratoires. Vous n’avez pas besoin d’être affilié à un grand centre de séquençage ou à une institution médicale pour effectuer ces expériences. L’élimination des tracas et des coûts liés à l’expédition des échantillons et à l’attente des résultats est un autre avantage du séquençage en interne.
D’autres séquenceurs plus gros sont abandonnés en raison des frais généraux importants des instruments. Les équations de recouvrement des coûts ne fonctionnent pas pour les grands centres centraux qui se dirigent vers le séquençage du génome entier. Des instruments plus petits pourraient devenir plus appropriés dans ces contextes.
Nous avons récemment commencé à utiliser le système Spectrum Compact CE de Promega et optimisé notre protocole sur cet instrument, ce qui nous a permis de réduire les coûts et de rendre notre travail disponible sur le terrain beaucoup plus rapidement qu’auparavant.
Disposer du Spectrum Compact nous aide à atteindre notre objectif de rendre le C. difficile base de données un service public et de réduire les coûts pour le terrain. En fin de compte, nous voulons que notre base de données soit compatible avec d’autres bases de données mondiales.
Selon vous, quel avenir pour le ribotypage et l’épidémiologie clinique ?
Ce que cela fait, c’est mettre un autre outil dans la boîte à outils. Je pense que le ribotypage par PCR fluorescent pourrait être très utile pour les cliniciens qui souhaitent savoir comment des souches spécifiques de C. difficile et d’autres agents pathogènes se répandent dans tout l’hôpital. Je pense que cela pourrait vraiment changer la donne pour les pratiques de contrôle des infections, car la méthode est si rapide.
L’autre domaine où cette technologie pourrait être d’une grande valeur est de permettre aux cliniciens d’établir si un cas est récurrent ou non. Une fois qu’un patient commence à récidiver avec C. difficile maladie, ils finissent souvent par se reproduire plusieurs fois, puis cela devient un scénario clinique très différent.
S’ils ramassent de nouvelles souches, leur microbiome est toujours sensible aux C. difficile l’infection, par rapport à l’existence d’une souche qui est revenue d’infections précédentes. Soit ils sont à nouveau contaminés par leur propre environnement, ce qui nécessiterait une décontamination complète, soit l’agent pathogène n’a pas été tué lors du premier cycle de traitement, une stratégie thérapeutique alternative pourrait donc être nécessaire.
En ce qui concerne l’avenir, je pense qu’une fois que les gens verront comment cette méthode fonctionne avec C. difficile, ils l’adapteront très probablement aux besoins spécifiques de leur hôpital ou de leur établissement. Toute méthode basée sur la PCR sera très adaptable à d’autres infections. Cela nous aide à garder le doigt sur le pouls de l’épidémiologie des maladies infectieuses et, espérons-le, à rester au courant des futures épidémies.
Pour plus d’informations sur le Walk Lab et pour télécharger le logiciel, veuillez visiter https://thewalklab.com/.
Pour plus d’informations sur le Spectrum Compact de Promega, veuillez visiter www.promega.com/SpectrumCompact
Les références
- Martinson JNV, Broadaway S, Lohman E, et al. Évaluation de la portabilité et du coût d’un protocole de ribotypage par PCR fluorescente pour Clostridium difficile Épidémiologie. J Clin Microbiol, 2015 ; 53(4) : 1192-1197.
À propos de Promega Corporation
Avec un portefeuille de plus de 3 000 produits couvrant les domaines de la génomique, de l’analyse et de l’expression des protéines, de l’analyse cellulaire, de la découverte de médicaments et de l’identité génétique, Promega est un leader mondial dans la fourniture de solutions innovantes et de soutien technique aux scientifiques de la vie dans les milieux académiques, industriels et gouvernementaux .
Les produits Promega sont utilisés par les scientifiques de la vie qui posent des questions fondamentales sur les processus biologiques ainsi que par les scientifiques qui appliquent les connaissances scientifiques pour diagnostiquer et traiter des maladies, découvrir de nouvelles thérapies et utiliser la génétique et les tests ADN pour l’identification humaine.