Technologie Light-Seq pour le codage à barres et le séquençage en profondeur de populations cellulaires sélectionnées dans les tissus

Au microscope, les chercheurs observent souvent différents types de cellules s’organisant selon des schémas particuliers dans les tissus, ou parfois un type de cellule rare qui se distingue en occupant une position unique, en présentant une forme inhabituelle ou en exprimant une molécule biomarqueur spécifique. Pour déterminer la signification plus profonde de leurs observations, ils ont développé des approches pour accéder également aux modèles d’expression génique des cellules (transcriptomes) en analysant les molécules d’ARN dérivées de gènes présentes en leur sein, qu’ils peuvent faire correspondre avec les formes, les positions spatiales et moléculaires des cellules. biomarqueurs.

Cependant, ces approches de «transcriptomique spatiale» ne capturent toujours qu’une fraction des molécules d’ARN totales d’une cellule et ne peuvent pas fournir la profondeur et la qualité d’analyse fournies par les méthodes de séquençage unicellulaire, qui ont été développées pour étudier les transcriptomes de cellules individuelles isolées à partir de tissus. ou biofluides passant par techniques de séquençage de nouvelle génération (NGS). Ils ne permettent pas non plus aux chercheurs de se concentrer uniquement sur des cellules spécifiques en fonction de leur emplacement dans un tissu, ce qui faciliterait grandement la poursuite de populations cellulaires disjointes, ou de cellules rares et difficiles à isoler comme des cellules cérébrales rares avec des fonctions uniques, ou des cellules immunitaires. cellules qui envahissent les tumeurs. De plus, comme l’environnement tissulaire d’origine est perturbé, de nombreuses transcriptomiques spatiales et toutes les méthodes de séquençage unicellulaire empêchent les chercheurs de revoir leurs échantillons pour effectuer une analyse de suivi, et elles sont coûteuses car elles nécessitent des instruments ou des réactifs spécialisés.

Une nouvelle avancée réalisée au Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering de l’Université de Harvard surmonte désormais ces limitations grâce à une méthode basée sur la nanotechnologie de l’ADN appelée « Light-Seq ». Light-Seq permet aux chercheurs de « géomarquer » le répertoire complet de séquences d’ARN avec des codes-barres d’ADN uniques exclusifs à quelques cellules d’intérêt. Ces cellules cibles sont sélectionnées à l’aide de la lumière sous un microscope passant par un processus de photoréticulation rapide et efficace.

À l’aide d’une nouvelle nanotechnologie d’ADN, les séquences d’ARN à code-barres sont ensuite traduites en brins d’ADN cohérents, qui peuvent ensuite être collectés à partir de l’échantillon de tissu et identifiés à l’aide de NGS. Le processus Light-Seq peut être répété avec différents codes-barres pour différentes populations de cellules dans le même échantillon, qui est laissé intact pour une analyse de suivi. Avec une performance comparable aux méthodes de séquençage unicellulaire, il élargit considérablement la profondeur et la portée des investigations possibles sur un échantillon de tissu. La méthode est publiée dans Méthodes naturelles .

« La combinaison unique de fonctionnalités de Light-Seq répond à un besoin non satisfait : la capacité d’effectuer une analyse de séquençage profond, basée sur l’imagerie, prescrite dans l’espace, de populations de cellules difficiles, voire impossibles à isoler, ou de types de cellules rares dans des tissus préservés, avec un – à une correspondance de leur état d’expression génique hautement raffiné avec des caractéristiques spatiales, morphologiques et potentiellement pertinentes pour la maladie », a déclaré Peng Yin, Ph.D., l’un des quatre auteurs correspondants et membre du corps professoral de l’Institut Wyss, où son groupe a développé Light-Seq. « Il a donc le potentiel d’accélérer le processus de découverte biologique dans divers domaines de recherche biomédicale. » Yin est également professeur de biologie des systèmes à la Harvard Medical School (HMS).

Du code-barres sur place au séquençage ex-situ

Le projet Light-Seq a été dirigé par Jocelyn (Josie) Kishi, Ph.D., Sinem Saka, Ph.D., et Ninning Liu, Ph.D. dans le groupe de Yin au Wyss, et Emma West, Ph.D. dans le laboratoire de Constance Cepko au HMS. Auparavant, Kishi et Saka avaient développé SABRE-FISH comme méthode de transcriptomique spatiale pour l’imagerie de l’expression des gènes directement dans les tissus intacts (sur place). « Avec SABRE-FISH, nous étions encore loin de capturer les programmes complets d’expression génique des cellules, avec plusieurs milliers de molécules d’ARN différentes par cellule. Les molécules d’ARN sont tout simplement trop denses pour être capturées dans leur intégralité à l’aide des techniques d’imagerie actuelles,  » a déclaré le co-premier et co-auteur correspondant Kishi. « Light-Seq résout ce problème en combinant un étiquetage de codes-barres haute résolution avec un séquençage du transcriptome complet via NGS, nous offrant le meilleur des deux mondes et des avantages clés supplémentaires. » Au moment de l’étude, Kishi était boursière en développement technologique Wyss dans l’équipe de Yin et poursuit maintenant une voie vers la commercialisation de Light-Seq avec certains de ses co-auteurs.

« Pour séquencer spécifiquement les cellules dans des emplacements sélectionnés sur mesure d’échantillons de tissus intacts, nous avons développé une nouvelle approche pour la photoréticulation des codes-barres d’ADN à des copies de molécules d’ARN, et une procédure basée sur la nanotechnologie de l’ADN qui les rend lisibles par NGS, ainsi que leurs séquences d’ARN attachées,  » a déclaré le co-premier auteur Liu, un boursier postdoctoral du groupe de Yin qui a précédemment co-développé une plate-forme de codage à barres ADN parallélisée pour une méthode d’imagerie à super-résolution appelée « Action-PAINT » qui est également devenue l’un des composants essentiels de Light-Seq.

Tout d’abord, les amorces d’ADN « s’apparient » avec des molécules d’ARN dans les cellules et sont étendues pour créer des copies des séquences d’ARN appelées séquences d’ADN complémentaires (ADNc). Ensuite, les brins de code-barres d’ADN contenant un nucléotide photoréticulant ultrarapide sont à leur tour appariés en bases aux ADNc dans les cellules. Celles-ci deviennent liées de manière permanente lorsqu’une cellule cible est éclairée sous le microscope à travers un dispositif optique semblable à un pochoir qui maintient les autres cellules non cibles dans le champ microscopique dans l’obscurité et les épargne ainsi de la réaction de photoréticulation. Après avoir lavé les séquences d’ADN à code-barres des cellules qui n’étaient pas liées de façon permanente sur placela procédure peut être répétée avec différents codes-barres et motifs lumineux pour étiqueter davantage de régions d’intérêt.

« Pour pouvoir intégrer ce flux de travail de codage à barres avec NGS, nous avons conçu une nouvelle réaction d’assemblage basée sur la nanotechnologie de l’ADN. Cette innovation nous permet de convertir nos ADNc à code-barres en séquences de lecture contiguës. Nous pouvons ensuite extraire la collection complète de code-barres portant séquences d’ADNc de l’échantillon et analysez-les avec des techniques NGS standard », a expliqué Saka, l’un des auteurs correspondants de l’étude qui est actuellement chef de groupe au Laboratoire européen de biologie moléculaire à Heidelberg, en Allemagne. « En fin de compte, chaque code à barres retrace la lecture complète du transcriptome jusqu’aux cellules présélectionnées dans l’échantillon de tissu, qui restent intactes pour les analyses ultérieures. Cela nous offre la chance unique de revoir exactement les mêmes cellules après le séquençage pour validation ou exploration plus approfondie.

Observer les tissus complexes et les cellules rares

Suite à la première validation de Light-Seq dans des cellules en culture, l’équipe de Yin a voulu l’appliquer à un tissu complexe et s’est associée au groupe de Constance Cepko, Ph.D. à HMS. Cepko est l’un des auteurs correspondants de l’étude et le professeur Bullard de génétique et de neurosciences à l’Institut Blavatnik du HMS, et étudie le développement de la rétine en tant que modèle du système nerveux. Kishi, Saka et Liu ont uni leurs forces avec West dans le groupe de Cepko pour appliquer Light-Seq à des coupes transversales de la rétine de la souris et profiler trois couches principales avec des fonctions différentes. Les chercheurs ont atteint une couverture de séquence comparable aux méthodes de séquençage unicellulaire et ont découvert que des milliers d’ARN étaient enrichis entre les trois couches principales de la rétine. Ils ont également montré qu’après l’extraction de la séquence, les échantillons de tissus restaient intacts et pouvaient encore être imagés pour les protéines et autres biomolécules.

« En poussant Light-Seq à l’extrême, nous avons pu isoler le transcriptome complet d’un type de cellule très rare, connu sous le nom de » cellules amacrines dopaminergiques « (DAC), qui est extrêmement difficile à isoler en raison de ses connexions complexes avec d’autres cellules dans la rétine, en récupérant simplement quatre à huit cellules à code-barres individuelles par coupe transversale », a déclaré West. Les DAC sont impliqués dans la régulation du rythme circadien de l’œil en ajustant la perception visuelle à différentes expositions à la lumière pendant le cycle jour-nuit. « Light-Seq a également détecté des ARN spécifiquement exprimés dans les DAC à de faibles niveaux, ainsi que des dizaines d’ARN biomarqueurs spécifiques aux DAC qui, à notre connaissance, n’avaient pas été décrits auparavant, ce qui ouvre de nouvelles opportunités pour étudier ce type de cellule rare. « , a ajouté West, qui au moment de l’étude était étudiante diplômée puis boursière postdoctorale chez Cepko, et a maintenant rejoint Kishi dans son effort de commercialisation de Light-Seq.

L’ouverture du domaine de la transcriptomique spatiale jusqu’au NGS ajoute également des informations sur le niveau d’une seule espèce d’ARN. « Nos données de séquençage ont clairement montré que Light-Seq peut déterminer les variations naturelles de la structure des ARN. À l’avenir, nous sommes très intéressés par l’utilisation de Light-Seq pour mieux comprendre l’interaction entre le système immunitaire, les cellules propagatrices de maladies et différents stratégies thérapeutiques telles que la thérapie génique et cellulaire », a déclaré Kishi.

La technologie Light-Seq développée dans le groupe de Peng Yin dans le cadre de l’initiative de robotique moléculaire de l’Institut Wyss montre une fois de plus comment la poursuite d’une approche totalement non conventionnelle et l’exploitation de la biologie synthétique peuvent conduire à une technologie perturbatrice avec un grand potentiel pour faire progresser à la fois la recherche fondamentale et la médecine clinique.

Donald Ingber, MD, Ph.D., directeur fondateur de Wyss

Donald Ingber est également le Judah Folkman Professeur de biologie vasculaire à la Harvard Medical School et au Boston Children’s Hospital, et le Hansjörg Wyss Professeur d’ingénierie bioinspirée à la Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.