Comment atterrir des gènes thérapeutiques en toute sécurité dans le génome humain
L’efficacité, la persistance et la prévisibilité de nombreuses futures thérapies géniques et cellulaires pour traiter des maladies telles que le cancer, les maladies génétiques rares et d’autres pourraient être améliorées par ce que l’on appelle les « sphères de sécurité génomiques (GSH) ». Ce sont des sites d’atterrissage dans le génome humain capables d’accueillir en toute sécurité de nouveaux gènes thérapeutiques sans provoquer d’autres changements involontaires dans le génome d’une cellule qui pourraient présenter un risque pour les patients.
Cependant, trouver des GSH ayant un potentiel de traduction clinique a été aussi difficile que de trouver un site d’atterrissage lunaire pour un vaisseau spatial – qui doit être sur un territoire lisse et accessible, pas trop escarpé et entouré de grandes collines ou falaises, offrir une bonne visibilité et permettre un retour en toute sécurité. De même, un GSH doit être accessible par les technologies d’édition du génome, exempt d’obstacles physiques comme les gènes et autres séquences fonctionnelles, et permettre une expression élevée, stable et sûre d’un gène thérapeutique « atterri ».
Jusqu’à présent, seuls quelques GSH candidats ont été explorés et ils s’accompagnent tous de certaines mises en garde. Soit ils sont situés dans des régions génomiques relativement denses en gènes, ce qui signifie qu’un ou plusieurs d’entre eux pourraient être compromis dans leur fonction par un gène thérapeutique inséré à proximité, soit ils contiennent des gènes ayant des rôles dans le développement du cancer qui pourraient être involontairement activé. De plus, les GSH candidats n’ont pas été analysés pour la présence d’éléments régulateurs qui, bien que n’étant pas des gènes eux-mêmes, peuvent réguler l’expression des gènes à distance, ni si les gènes insérés modifient les schémas d’expression génique globaux dans les cellules de l’ensemble du génome.
Maintenant, une collaboration de chercheurs du Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering de Harvard, de la Harvard Medical School (HMS) et de l’ETH Zurich en Suisse, a développé une approche informatique pour identifier les sites GSH avec un potentiel significativement plus élevé pour l’insertion sûre de gènes thérapeutiques et leur expression durable dans de nombreux types de cellules. Pour deux des 2 000 sites GSH prévus, l’équipe a fourni une validation approfondie avec des thérapies cellulaires T adoptives et in vivo thérapies géniques pour les maladies de la peau à l’esprit. En concevant les sites GSH identifiés pour qu’ils portent respectivement un gène rapporteur dans les cellules T et un gène thérapeutique dans les cellules de la peau, ils ont démontré une expression sûre et durable des gènes nouvellement introduits. L’étude est publiée dans Méthodes des rapports de cellule.
« Alors que les GSH pourraient être utilisés comme plates-formes d’atterrissage universelles pour le ciblage des gènes, et ainsi accélérer le développement clinique des thérapies géniques et cellulaires, jusqu’à présent, aucun site du génome humain n’a été entièrement validé et tous ne sont acceptables que pour les applications de recherche », a déclaré George Church, Ph.D., membre du corps professoral de Wyss Core, auteur principal de l’étude. « Cela fait de l’approche collaborative que nous avons adoptée vers des GSH hautement validés un pas en avant important. Associés à des outils d’intégration de gènes ciblés plus efficaces que nous développons en laboratoire, ces GSH pourraient renforcer une variété d’efforts futurs de traduction clinique. Church est un chef de file de la plate-forme de biologie synthétique du Wyss Institute, ainsi que le professeur Robert Winthrop de génétique au HMS et professeur de sciences et de technologie de la santé à l’Université de Harvard et au Massachusetts Institute of Technology (MIT).
Tamiser le génome pour les GSH
Les chercheurs ont d’abord mis en place un pipeline informatique qui leur a permis de prédire les régions du génome susceptibles d’être utilisées comme GSH en exploitant la richesse des données de séquençage disponibles à partir de lignées cellulaires et de tissus humains. « Dans cette analyse étape par étape du génome entier, nous avons exclu par calcul les régions codant pour les protéines, y compris les protéines qui ont été impliquées dans la formation de tumeurs, et les régions codant pour certains types d’ARN ayant des fonctions dans l’expression des gènes et d’autres processus cellulaires. Nous avons également éliminé les régions qui contiennent des éléments dits activateurs, qui activent l’expression des gènes, souvent de loin, et les régions qui comprennent les centres et les extrémités des chromosomes pour éviter les erreurs de réplication et de ségrégation des chromosomes lors de la division cellulaire », a déclaré le premier. -auteur Erik Aznauryan, Ph.D. « Cela nous a laissé environ 2 000 loci candidats à étudier plus avant à des fins cliniques et biotechnologiques. »
Aznauryan a commencé le projet en tant qu’étudiant diplômé avec d’autres membres du laboratoire de Sai Reddy au Département des sciences et de l’ingénierie des biosystèmes de l’ETH Zurich avant de visiter le laboratoire de l’Église dans le cadre de ses travaux de troisième cycle, où il s’est associé à Denitsa Milanova, Ph. .RÉ. Depuis, il s’est joint au groupe de Church en tant que boursier postdoctoral. Reddy, auteur principal et principal de l’étude collaborative, est professeur associé d’immunologie systémique et synthétique à l’ETH Zurich et se concentre sur le développement de nouvelles méthodes en biologie systémique et synthétique pour concevoir des cellules immunitaires pour diverses recherches et applications cliniques.
Sur les 2 000 sites GSH identifiés, l’équipe en a sélectionné cinq au hasard et les a étudiés dans des lignées cellulaires humaines communes en insérant des gènes rapporteurs dans chacun d’eux à l’aide d’une stratégie d’édition du génome rapide et efficace basée sur CRISPR-Cas9. « Deux des sites GSH ont permis une expression particulièrement élevée du gène rapporteur inséré – en fait, nettement plus élevée que les niveaux d’expression atteints par l’équipe avec le même gène rapporteur conçu dans deux GSH de génération précédente. Il est important de noter que les gènes rapporteurs hébergés par les deux sites GSH n’ont régulé à la hausse aucun gène lié au cancer », a déclaré Aznauryan. Cela peut également devenir possible parce que des régions du génome éloignées les unes des autres dans la séquence d’ADN linéaire des chromosomes, mais proches dans le génome tridimensionnel, dans lesquelles différentes régions de chromosomes repliés se touchent, peuvent être affectées conjointement lorsqu’un gène supplémentaire est inséré.
Traduction clinique
Pour évaluer les deux sites GSH les plus convaincants dans les types de cellules humaines présentant un intérêt pour les thérapies cellulaires et géniques, l’équipe les a étudiés respectivement dans les cellules T immunitaires et les cellules de la peau. Les cellules T sont utilisées dans un certain nombre de thérapies cellulaires adoptives pour le traitement du cancer et des maladies auto-immunes qui pourraient être plus sûres si le gène codant pour le récepteur était inséré de manière stable dans un GSH. En outre, les maladies de la peau causées par des mutations nocives dans les gènes contrôlant la fonction des cellules dans différentes couches de la peau pourraient potentiellement être guéries par l’insertion et l’expression à long terme d’une copie saine du gène muté dans un GSH de cellules cutanées en division qui reconstituent ces couches.
«Nous avons introduit un gène rapporteur fluorescent dans deux nouveaux GSH dans des cellules T humaines primaires obtenues à partir de sang, et un gène entièrement fonctionnel AGNEAU3 gène, une protéine extracellulaire de la peau, dans les mêmes GSH dans les fibroblastes dermiques humains primaires, et a observé une activité de longue durée », a déclaré Milanova. « Bien que ces GSH soient particulièrement bien placés pour améliorer les niveaux et la persistance de l’expression génique dans les cellules mères et filles à des fins thérapeutiques, je suis particulièrement enthousiasmé par les améliorations cellulaires émergentes de « gain de fonction » qui pourraient augmenter le fonctionnement normal des cellules et des organes. L’aspect sécurité est alors d’une importance primordiale. Avec une équipe entrepreneuriale au Wyss, Milanova développe une plateforme de rajeunissement et d’améliorations génétiques axée sur le rajeunissement de la peau.
« Une analyse de séquençage approfondie que nous avons entreprise dans des cellules T humaines primaires conçues par GSH a clairement démontré que l’insertion a un potentiel minime de provoquer des effets favorisant la tumeur, ce qui est toujours une préoccupation majeure lors de la modification génétique de cellules à des fins thérapeutiques », a déclaré Reddy. « L’identification de plusieurs sites GSH, comme nous l’avons fait ici, soutient également le potentiel de développement de thérapies cellulaires plus avancées qui utilisent plusieurs transgènes pour programmer des réponses cellulaires sophistiquées, ce qui est particulièrement pertinent dans l’ingénierie des cellules T pour l’immunothérapie contre le cancer. »
« Cet effort de collaboration interdisciplinaire démontre la puissance de l’intégration d’approches informatiques à l’ingénierie du génome tout en maintenant l’accent sur la traduction clinique. L’identification des GSH dans le génome humain augmentera considérablement les futurs efforts thérapeutiques de développement axés sur l’ingénierie de thérapies géniques et cellulaires plus efficaces et plus sûres », a déclaré le directeur fondateur de Wyss, Donald Ingber, MD, Ph.D., qui est également le Judah Folkman Professeur de biologie vasculaire au HMS et au Boston Children’s Hospital, et professeur de bio-ingénierie à la Harvard John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences.
Référence: Aznauryan E, Yermanos A, Kinzina E, et al. Découverte et validation de sites refuges génomiques humains pour les thérapies géniques et cellulaires. Méthodes des rapports de cellule. 2022;2(1). doi : 10.1016/j.crmeth.2021.100154.
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