CRISPRoff: un nouvel ajout à la boîte à outils CRISPR

Au cours de la dernière décennie, le système d’édition de gènes CRISPR-Cas9 a révolutionné le génie génétique, permettant aux scientifiques d’apporter des modifications ciblées à l’ADN des organismes. Alors que le système pourrait potentiellement être utile dans le traitement de diverses maladies, l’édition CRISPR-Cas9 implique la coupure des brins d’ADN, conduisant à des modifications permanentes du matériel génétique de la cellule.

Maintenant, dans un article publié en ligne dans Cell le 9 avril, les chercheurs décrivent une nouvelle technologie d’édition de gène appelée CRISPRoff qui permet aux chercheurs de contrôler l’expression des gènes avec une spécificité élevée tout en laissant la séquence de l’ADN inchangée. Conçue par Jonathan Weissman, membre de l’Institut Whitehead, professeur adjoint à l’Université de Californie à San Francisco, Luke Gilbert, postdoctorant du laboratoire Weissman James Nuñez et collaborateurs, la méthode est suffisamment stable pour être héritée à travers des centaines de divisions cellulaires et est également entièrement réversible.

«La grande histoire ici est que nous avons maintenant un outil simple qui peut faire taire la grande majorité des gènes», dit Weissman, qui est également professeur de biologie au MIT et chercheur au Howard Hughes Medical Institute. «Nous pouvons le faire pour plusieurs gènes en même temps sans aucun dommage à l’ADN, avec une grande homogénéité et d’une manière qui peut être inversée. C’est un excellent outil pour contrôler l’expression des gènes. »

Le projet a été partiellement financé par une subvention de 2017 de la Defense Advanced Research Projects Agency pour créer un éditeur de gènes réversible. «Avance rapide de quatre ans [from the initial grant], et CRISPRoff fonctionne enfin comme prévu à la manière de la science-fiction », déclare le co-auteur principal Gilbert. «C’est excitant de voir que cela fonctionne si bien dans la pratique.»

Génie génétique 2.0

Le système CRISPR-Cas9 classique utilise une protéine coupant l’ADN appelée Cas9 trouvée dans le système immunitaire bactérien. Le système peut être ciblé sur des gènes spécifiques dans des cellules humaines en utilisant un seul ARN guide, où les protéines Cas9 créent de minuscules cassures dans le brin d’ADN. Ensuite, les machines de réparation existantes de la cellule réparent les trous.

Parce que ces méthodes modifient la séquence d’ADN sous-jacente, elles sont permanentes. De plus, leur dépendance vis-à-vis des mécanismes de réparation cellulaire «internes» signifie qu’il est difficile de limiter le résultat à un seul changement souhaité. «Aussi beau que soit CRISPR-Cas9, il confie la réparation aux processus cellulaires naturels, qui sont complexes et multiformes», déclare Weissman. «Il est très difficile de contrôler les résultats.»

C’est là que les chercheurs ont vu une opportunité pour un autre type d’éditeur de gènes – un éditeur qui n’a pas modifié les séquences d’ADN elles-mêmes, mais a changé la façon dont elles étaient lues dans la cellule.

Ce type de modification est ce que les scientifiques appellent «épigénétique» – les gènes peuvent être réduits au silence ou activés en fonction des modifications chimiques du brin d’ADN. Les problèmes d’épigénétique d’une cellule sont responsables de nombreuses maladies humaines telles que le syndrome du X fragile et divers cancers, et peuvent être transmis de génération en génération.

Le silençage épigénétique des gènes fonctionne souvent par méthylation – l’ajout d’étiquettes chimiques à certains endroits du brin d’ADN – qui rend l’ADN inaccessible à l’ARN polymérase, l’enzyme qui lit les informations génétiques de la séquence d’ADN dans des transcriptions d’ARN messager, qui peuvent en fin de compte être les modèles pour les protéines.

Weissman et ses collaborateurs avaient précédemment créé deux autres éditeurs épigénétiques appelés CRISPRi et CRISPRa – mais les deux étaient accompagnés d’une mise en garde. Pour qu’elles fonctionnent dans les cellules, les cellules devaient continuellement exprimer des protéines artificielles pour maintenir les changements.

«Avec cette nouvelle technologie CRISPRoff, vous pouvez [express a protein briefly] pour écrire un programme dont la cellule se souvient et est exécuté indéfiniment », explique Gilbert. «Cela change la donne, donc maintenant vous écrivez essentiellement un changement qui est transmis par les divisions cellulaires – à certains égards, nous pouvons apprendre à créer une version 2.0 de CRISPR-Cas9 qui est plus sûre et tout aussi efficace, et qui peut faire tout cela. d’autres choses aussi.

Construire le commutateur

Pour construire un éditeur épigénétique qui pourrait imiter la méthylation naturelle de l’ADN, les chercheurs ont créé une minuscule machine à protéines qui, guidée par de petits ARN, peut coller des groupes méthyle sur des points spécifiques du brin. Ces gènes méthylés sont ensuite «réduits au silence» ou désactivés, d’où le nom CRISPRoff.

Parce que la méthode ne modifie pas la séquence du brin d’ADN, les chercheurs peuvent inverser l’effet de silençage en utilisant des enzymes qui éliminent les groupes méthyle, une méthode qu’ils ont appelée CRISPRon.

En testant CRISPRoff dans différentes conditions, les chercheurs ont découvert quelques caractéristiques intéressantes du nouveau système. D’une part, ils pourraient cibler la méthode sur la grande majorité des gènes du génome humain – et cela a fonctionné non seulement pour les gènes eux-mêmes, mais aussi pour d’autres régions de l’ADN qui contrôlent l’expression des gènes mais ne codent pas pour les protéines. «Cela a été un énorme choc même pour nous, car nous pensions que cela ne s’appliquerait qu’à un sous-ensemble de gènes», déclare le premier auteur Nuñez.

Aussi, étonnamment pour les chercheurs, CRISPRoff était même capable de faire taire des gènes qui n’avaient pas de grandes régions méthylées appelées îlots CpG, qui avaient auparavant été jugés nécessaires à tout mécanisme de méthylation de l’ADN.

«Ce que l’on pensait avant ce travail était que les 30 pour cent des gènes qui n’ont pas d’îlot CpG n’étaient pas contrôlés par la méthylation de l’ADN», explique Gilbert. «Mais notre travail montre clairement que vous n’avez pas besoin d’un îlot CpG pour désactiver les gènes par méthylation. Cela a été pour moi une grande surprise.

CRISPRoff dans la recherche et la thérapie

Pour étudier le potentiel de CRISPRoff pour des applications pratiques, les scientifiques ont testé la méthode dans des cellules souches pluripotentes induites. Ce sont des cellules qui peuvent se transformer en d’innombrables types de cellules dans le corps en fonction du cocktail de molécules auxquelles elles sont exposées, et sont donc des modèles puissants pour étudier le développement et la fonction de types de cellules particuliers.

Les chercheurs ont choisi un gène pour faire taire les cellules souches, puis les ont incités à se transformer en cellules nerveuses appelées neurones. Lorsqu’ils ont recherché le même gène dans les neurones, ils ont découvert qu’il était resté silencieux dans 90% des cellules, révélant que les cellules conservent une mémoire des modifications épigénétiques apportées par le système CRISPRoff même lorsqu’elles changent de type cellulaire.

Ils ont également sélectionné un gène à utiliser comme exemple de la façon dont CRISPRoff pourrait être appliqué à la thérapeutique: le gène qui code pour la protéine Tau, impliquée dans la maladie d’Alzheimer. Après avoir testé la méthode dans les neurones, ils ont pu montrer que l’utilisation de CRISPRoff pouvait être utilisée pour réduire l’expression de Tau, mais pas entièrement. «Ce que nous avons montré, c’est qu’il s’agit d’une stratégie viable pour faire taire Tau et empêcher l’expression de cette protéine», déclare Weissman. «La question est, alors, comment livrez-vous cela à un adulte? Et serait-ce vraiment suffisant pour avoir un impact sur la maladie d’Alzheimer? Ce sont de grandes questions ouvertes, en particulier la dernière. »

Même si CRISPRoff ne conduit pas à des thérapies contre la maladie d’Alzheimer, il existe de nombreuses autres conditions auxquelles il pourrait potentiellement s’appliquer. Et bien que la livraison à des tissus spécifiques reste un défi pour les technologies d’édition de gènes telles que CRISPRoff, «nous avons montré que vous pouvez le fournir de manière transitoire sous forme d’ADN ou d’ARN, la même technologie qui est à la base du vaccin contre les coronavirus Moderna et BioNTech», Weissman dit.

Weissman, Gilbert et leurs collaborateurs sont également enthousiasmés par le potentiel de CRISPRoff pour la recherche. «Puisque nous pouvons maintenant faire taire n’importe quelle partie du génome que nous voulons, c’est un excellent outil pour explorer la fonction du génome», dit Weissman.

De plus, disposer d’un système fiable pour modifier l’épigénétique d’une cellule pourrait aider les chercheurs à apprendre les mécanismes par lesquels les modifications épigénétiques sont transmises à travers les divisions cellulaires. «Je pense que notre outil nous permet vraiment de commencer à étudier le mécanisme de l’héritabilité, en particulier l’héritabilité épigénétique, qui est une énorme question dans les sciences biomédicales», dit Nuñez.

Référence: Nuñez JK, Chen J, Pommier GC et coll. Mémoire transcriptionnelle programmable à l’échelle du génome par édition d’épigénome basée sur CRISPR. Cellule. 2021; 0 (0). doi: 10.1016 / j.cell.2021.03.025

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